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用酶解苦蕎麩皮蛋白生產(chǎn)活性肽方法

放大字體  縮小字體發(fā)布時間:2017-09-20  瀏覽次數(shù):812
導(dǎo)讀:苦蕎的營養(yǎng)價值不僅在于常量營養(yǎng)成分組成特殊,其蛋白質(zhì)的必需氨基酸組成合理,淀粉中抗性淀粉比例較高,脂肪中的不飽和脂肪酸比...

苦蕎的營養(yǎng)價值不僅在于常量營養(yǎng)成分組成特殊,其蛋白質(zhì)的必需氨基酸組成合理,淀粉中抗性淀粉比例較高,脂肪中的不飽和脂肪酸比例很高,而且含有多種微量元素、手性肌醇、蘆丁、槲皮素等對人體具有保健作用的成分。正是由于這些特殊的營養(yǎng)組成,使得苦蕎具有降血糖、降血脂、降血壓、抗貧血、抗疲勞、抗氧化等多項保健功能。

1.酶解原料的制備

苦蕎麩皮蛋白是以提取黃酮后的苦蕎麩皮為原料,通過堿法提取等電沉淀制備得到。該蛋白主要由清蛋白和球蛋白組成,其中氨基酸組成比較豐富且疏水性氨基酸、芳香族氨基酸、脯氨酸和精氨酸等含量較高,而這些氨基酸有利于得到含量較高的活性肽物質(zhì)。

用該蛋白作為酶解的原料,不僅容易得到具有一定氨基酸組成的目標產(chǎn)物,而且使資源得到了綜合利用,同時又排除了其活性源于黃酮的假設(shè),從而簡化了工藝。

2.苦蕎麩皮肽的生產(chǎn)

(1)預(yù)處理在酶水解之前,應(yīng)該對酶解原料進行必要的高溫預(yù)處理,目的有3個:①使蛋白質(zhì)變性。打開肽鏈結(jié)構(gòu),使分子結(jié)構(gòu)松散,增加酶的作用位點,同時降低溶液的黏度,使分子運動更加自如,從而加快水解速度。②殺菌。避免雜菌過度生長,而出現(xiàn)不可預(yù)期的水解效果或者使其表觀水解度增大。③純化胰蛋白酶抑制因子。使后期的水解過程中胰蛋白酶能夠發(fā)揮正常作用。

(2)酶的選擇與應(yīng)用為了得到含量更高、活性更好、成本更低的肽類物質(zhì),應(yīng)該從以下4個方面進行酶的選擇:①酶的種類。應(yīng)該選擇內(nèi)肽酶,而不應(yīng)選擇端肽酶,從而避免水解產(chǎn)物中出現(xiàn)過多的游離氨基酸,提高產(chǎn)率并減少因氨基酸過多所帶來的測定干擾及后續(xù)分離難度。另外最好根據(jù)水解的特異性進行選擇。②酶的來源?紤]到食用的安全性及生物活性的正常發(fā)揮,應(yīng)盡量選擇來自動物消化道的酶系,如胃蛋白酶、胰蛋白酶。另外,堿性蛋白酶(Alcalase)是微生物酶,來源廣泛、成本低,適合工業(yè)化生產(chǎn),是較理想的工業(yè)用酶。③酶的最適條件。由于最終的生物活性要經(jīng)過人體消化系統(tǒng)的檢驗,所以在酶解時盡量選擇與人體胃腸道環(huán)境相接近的酶系,這樣可避免體內(nèi)外活性出現(xiàn)高度反差。④多酶復(fù)合體系的篩選。在對復(fù)合酶進行水解條件優(yōu)化時,不應(yīng)盲目地將酶任意組合,也不宜將水解度大的酶兩兩組合;蛟S兩種水解度高的酶作用位點相同,將兩酶復(fù)合后自然不會引起水解度的增加。相反,將水解度高的酶與水解度低的酶結(jié)合使用,有可能獲得更好的水解度或得到活性更強的目標肽。

(3)指標設(shè)定目前,活性肽的生產(chǎn)都是以水解度(水解度是指被水解的肽鍵的數(shù)目和原料蛋白的肽鍵數(shù)目的比值)作為衡量指標,分析大量資料后發(fā)現(xiàn),水解度不宜作為活性肽生產(chǎn)的指標,而應(yīng)以最終的活性作為指標,原因有4個:①游離氨基酸過分地強調(diào)水解度,會造成蛋白質(zhì)的過度水解,產(chǎn)生過多的游離氨基酸,而多肽得率下降。②酶的種類和來源由于不同酶的作用位點不同,切下來的肽鏈結(jié)構(gòu)和長度不同,對水解度的貢獻自然也不同,但其活性卻有可能相同。③預(yù)處理雜菌過度生長,會出現(xiàn)不可預(yù)期的水解效果,并使表觀水解度增大,但未必會得到活性很高的產(chǎn)物。④水解度本身就很難精確得到確定水解度時要用到多項檢測值和多種試劑,這必然會增加測定誤差;不利于得到準確的水解度值?梢酝ㄟ^以水解時間、水解過程中消耗的氫氧化鈉體積數(shù)和可溶性氮等指標作出大致的估計。

水解過程中消耗的氫氧化鈉體積數(shù)水解度測定方法是基于水解過程中pH值不斷變化,為了使體系的pH值保持恒定,就要不斷地滴加氫氧化鈉,所以通過消耗的氫氧化鈉體積數(shù)就可大致掌握水解的程度。

可溶性氮指標則隨著水解的進行,肽鏈越來越短,溶解度則相應(yīng)增大,通過測定可溶性氮的增加量或者濁度的降低值,即可大致估計水解的程度。

(4)活性測定將活性作為最終檢測指標的情況下,選擇或建立一種高效快速、準確靈敏、經(jīng)濟實用、簡便易行的檢測方法就顯得尤為重要。如目前降血壓活性的測定方法有分光光度法、熒光光度法、放射化學(xué)法、高效液相色譜法、毛細管膠束電動色譜法、高效毛細管電泳法等,可以根據(jù)自身條件選擇不同的方法。

(5)活性肽的分離、純化和表征酶法水解苦蕎麩皮蛋白生產(chǎn)的活性肽其理化性質(zhì)可能完全不同,如分子量分布、氨基酸組成、帶電量、pH值、極性,因而對于具有生理活性的目的產(chǎn)物其分離純化方法可能會有很大的不同。另一方面,往往在一種酶解條件下得到的目標產(chǎn)物的分離純化方法和條件彳艮難移植于另一條件下的產(chǎn)物。所以活性肽的分離和純化是一項很復(fù)雜很艱巨的工作。

在進行分離純化時,最好是將分離原理不同的兩種或多種手段結(jié)合使用,從而使得到的目標產(chǎn)物更純。如凝膠層析和電泳結(jié)合使用,離子交換和分配層析結(jié)合、HPLC和超濾結(jié)合等等都已成功地用于活性物質(zhì)的分離和純化。

3.發(fā)展方向

(1)苦味脫除可能導(dǎo)致的功能性降低問題在蛋白質(zhì)水解生產(chǎn)肽的過程中,必然伴隨有苦味的產(chǎn)生。目前已有許多相關(guān)的研究報道,但大多集中在對苦味機理的推測及苦味的脫除這兩方面,今后宜側(cè)重從源頭上切斷或減弱苦味的產(chǎn)生以及在生產(chǎn)過程中進行脫苦。從已有的報道看,脫苦都是先分離到活性肽然后對其苦味進行評價。對活性肽的評價應(yīng)重在功效,如果沒有發(fā)現(xiàn)對人體不利的影響,則不應(yīng)該盲目地脫苦。應(yīng)當在處理前后對活性作進一步測定,再根據(jù)活性降低情況決定要不要脫苦。可能的話,還應(yīng)該對脫下來的苦味作單獨的活性測定。

(2)活性的差異最終產(chǎn)品的活性必須經(jīng)過人體的臨床試用才能得到真正的檢驗。許多資料表明,活性肽在試驗動物和人體、體外和體內(nèi)表現(xiàn)出不同的活性。在以后的研究中應(yīng)予注意。

(3)對酶水解物進行多種活性的測定天然產(chǎn)物往往具有多種生物活性,而目前的研究大多研究一種活性,對同一水解物進行多種生理活性功能的平行測試,可以擴大最終產(chǎn)物的適用人群范圍,從而為產(chǎn)品進入市場作好準備,為基礎(chǔ)研究、產(chǎn)品開發(fā)和市場運營提供更好的銜接。

 
 
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